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　　三、Lp(a)-C的测定方法
　　1、概述：近年来，国内外相继报道了几种直接测定Lp(a)-C的方法，如超速离心法、麦胚血凝素法、琼脂糖凝胶电泳法等。这些方法的优点在于可避免免疫测定法中因apo(a)多态性给Lp(a)测定带来的难题。Lp(a)-C的测定的临床应用价值已引起越来越多研究者的重视。

　　2、超速离心法：Kuikarni等将50ml血浆用d=1.21kg/L的KBr稀释30倍后，一次短时间垂直超速离心法分离各种脂蛋白，然后以流动式分析仪测定各种脂蛋白胆固醇。其中Lp(a)-C结果与免疫分析法具有较好的相关性。另外，Nauck等先用超速离心法去除血浆VLDL(d=1.006kg/L)后，剩余部分进行琼脂糖凝胶电泳分离LDL与Lp(a)，然后用胆固醇酶试剂染色，以光密度计扫描定量，即可确定Lp(a)-C值。此法测定Lp(a)-C与INA法测定Lp(a)结果具有较好相关性(r=0.972)。这类方法操作复杂，且需特殊仪器，一般应用较少。

　　3、麦胚血凝素法：由于apo(a)是一种含糖多的蛋白质，富含N-乙酰-D-神经氨酸及N-乙酰-D-葡萄糖胺残基，这类物质是麦胚血凝素(WGA，为植物血凝素的一种)最好的配体。基于这一原理，Seman等报导了用WGA分离Lp(a)后，用酶法测定与WGA结合的胆固醇，测定Lp(a)-C的方法。此法精密度高，与ELISA法测定Lp(a)具有较好的相关性(r=0.997)。目前Genzyme Diagnostics公司已有可供自动生化分析仪应用的试剂盒。Framingham研究显示，正常人群Lp(a)-C水平无性别、年龄差异，Lp(a)-C在0.259mmol/L(10mg/dl)以上是男性冠心病的相对危险因素。

　　4、琼脂糖凝胶电泳法：将传统的琼脂糖凝胶脂蛋白电泳技术进行改良，结合胆固醇酶试剂染色，即可很好分离LDL、VLDL、前b脂蛋白[Lp(a)]和HDL四条区带，通过扫描即可确定各自所占百分含量，结合血清TC值，则可同时对这4种脂蛋白胆固醇[HDL-C、LDL-C、VLDL-C 与Lp(a)-C]进行定量。Nauck等研究认为，电泳法测定Lp(a)-C的CV为6.8%~16.4%，Lp(a)-C值(Y)与INA测定Lp(a)值(X)呈线性相关(r=0.906)，Y=4.21mg/dl+0.238X。目前Helena公司已有供REP全自动快速电泳仪用的脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所用标本少(1ml血清)，操作简便，整个测定能在1h完成，自动化程度高，非常适合临床常规采用。

　　四、Lp(a)测定的标准化
　　数次国际性的Lp(a)室间调查表明，不同实验室之间Lp(a)结果差异很大，说明检测质量问题严重，急需进行标准化工作。Lp(a)组成、大小、密度不均一性即Lp(a)的多态性是Lp(a)测定标准化的最大困难之一。试剂盒的分析性能差异、缺乏国际公认的二级参考材料、Lp(a)的报告方式等也是影响Lp(a)标准化的重要因素。1995年国际临床化学联合会(IFCC)组织了Lp(a)标准化工作组[IFCC WG Lp(a)]，提出的优先考虑的问题包括：制定参考方法、单克隆与多克隆抗体的实用性比较、分析种类(ELISA法中以抗apoB或抗apo(a)为测定抗体的对比)、方法间与实验室间测定值的转移、参考物质(一级与二级)与质控物、apo(a)异构体的重要性、结果表示方式[质量、颗粒数或Lp(a)-C]及不同人群的参考值等。为选择一个合适的二级参考材料，使不同分析系统之间Lp(a)测定结果具有良好可比性，IFCC WG Lp(a)的标准化程序分为三个阶段：第一阶段对现有Lp(a) 测定系统的分析性能和商用Lp(a)校准品的互换性进行评价。第二阶段选择合适的Lp(a)测定的校准品，对其进行稳定性监测，在最佳条件下评价其分析性能，此外，选择对校准品定值的Lp(a)测定方法。第三阶段用二级Lp(a)参考材料(SRM)检测一批新鲜冰冻血清样本，检验方法的可比性及对偏差进行估计。

　　IFCC WG Lp(a)第一阶段对40个测定系统通过检验血清标本与厂家提供的Lp(a)校准品进行了分析性能评价，如精密度、线性与一致性观察。所用方法有Lp(a)-C麦胚血凝素法(1个)、DELFIA法(2个)、EID法(2个)、ELISA法(9个)、INA法(7个)、ITA法(共17个，其中5个为ITA-Latex)与RIA法(2个)。根据混合血清测定结果来看，20个测定系统不理想，其中16个线性不符要求，4个精密度不好。从一些厂家校准品显示的可接受的分析性能及Lp(a)测定值的一致性来看，有4个推荐校准品(PRM)有可能成为参考材料。35个Lp(a)测定系统(包括22个生产厂家)参加了IFCC WG Lp(a)第二阶段对第一阶段保留的4个候选参考材料进行分析性能、可替代性及方法一致性比较的实验。精密度与线性实验结果表明，4种材料之间具有可比性。一致性实验显示测定系统间Lp(a)校正值的变异系数为11%~22%。这些材料在18个INA与ITA测定系统之间一致性最好(变异系数小于8%)。这种变异可部分解释Lp(a)测定的不准确性可能是由于apo(a)分子大小多态性所致。基于可接受的分析性能、最大的方法学一致性、最小的变异及稳定性等指标考虑，IFCC Lp(a)标准化工作组选定PRM 2B冻干品作为通用校准品(候选二级参考材料)，用于生产厂家之间 Lp(a)值的转移过程。IFCC WG Lp(a)第三阶段工作在美国西北脂质实验室(MWLRL)的协调下，有16个试剂生产厂家，6个Lp(a)标准化实验室，22个Lp(a)测定系统参加。已完成PRM的制备、靶值的确定及靶值的转移等工作。