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二、Lp(a)的测定方法
1、概述：早期检测Lp(a)多用电泳法，观察b和前b脂蛋白之间是否出现额外的Lp(a)区带，但此法灵敏度低，多用于定性检测。随后相继研制开发出一些直接测定Lp(a)的免疫化学检测法，如辐射状免疫扩散法(RID)、电免疫扩散法(EID)、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫浊度法[包括免疫散射比浊法(INA)和免疫透射比浊法(ITA)]、解离增强配体荧光免疫测定法(DELFIA)等。RID法与EID法因操作简便，不需特殊设备，仍有一些基层单位实验室采用，但缺点是灵敏度低。RIA法的缺点是操作复杂，有放射性核素污染。DELFIA法因需特殊仪器，国内也较少应用。各种方法测定Lp(a)所得参考值相近，目前国内外所采用的判断标准基本相同。一般认为300mg/L为临界水平，大于300mg/L以上为病理水平。
2、ELISA法：国内外商品试剂盒多采用直接法或非竞争双抗夹心法。此法的主要优点是 (1)标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响。
(2)基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。
广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物(如Chol测定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物)。但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素(如粘度、pH等)的影响。基质效应(matrix effect)不明显、灵敏特异、抗体用量少、血清标本用量少、操作简便、不需要特殊仪器，一般实验室均可开展。缺点是精密度较差，难以自动化，易出现交叉反应(如与PLG、apoB)。研究表明，用apo(a)多克隆抗体(PcAb)作为包被抗体，apo(a)PcAb或apoB PcAb作酶标抗体，结果均呈现用apoB酶标抗体测定Lp(a)低于apo(a)酶标抗体。有人主张用apoB酶标抗体以彻底排除PLG干扰。用人Lp(a)制备的兔或羊抗血清应吸收PLG及apoB后才能应用。制备单克隆抗体(McAb)时，选择只作用于apo(a)的抗原位点，而与PLG及apoB没有交叉反应的抗体，且最好选择不表达K4T2抗原决定簇的McAb，以免测定结果受apo(a)分子大小的影响。常用的反应体系为：用亲和力高的抗apo(a) McAb或 PcAb作为包被抗体，用以捕获标本或标准血清中的apo(a)，用不表达K4T2抗原决定簇的抗apo(a) McAb或抗apoB抗体(PcAb或McAb均可)作为测定抗体(酶标抗体)。近来也有作者选用不同抗apo(a)K4T5~蛋白酶区的McAb株分别作包被抗体与酶标抗体，以避免apo(a)分子多态性的影响。Marcovina等建议对于商品定标血清，可用Lp(a)的蛋白质表示，分析原始标准物的氨基酸，根据apo(a)或apoB的氨基酸组成计算apo(a)蛋白的摩尔浓度，然后用此原始标准去标定新鲜冰冻血浆中的Lp(a)浓度(nmol/L)。
3、免疫浊度法：这类方法的优点是快速简便、精密度高、易于自动化、适于大批量标本的同时检测。缺点是抗体用量大(为ELISA的数倍)，对抗体要求高(应具有高特异性、高滴度和高亲和力)，颗粒大小不同的Lp(a)会产生不一致的光散射与光吸收，而且受标本中的基质的影响较明显。其中INA法分速率法和终点法二类，需要专门仪器(散射比浊仪或一些特种蛋白仪等)与专用配套试剂，测定成本较高。ITA法可用一般半自动、全自动生化分析仪，更易被常规分析所采用。由于大多数生化自动分析仪要求检测反应在10分钟内完成，所以对所用试剂要求较高，其必须有高活性的抗血清和合适的反应体系。目前多用亲和层析法纯化PcAb或McAb制备高活性抗血清，在聚乙二醇(PEG)反应体系中加入表面活性剂，以加快反应速度和减少非特异性反应。国内建议免疫浊度法作为临床实验室测定血清Lp(a)的常规方法。试剂所用抗体应为多克隆抗体或混合数株识别apo(a)上不同抗原位点的单克隆抗体。首选ITA法，其次为INA法。推荐用液体双试剂，采用多点定标(5-7点)，用log-logit转换或Y=AX3+BX2+CX+D 3次方程回归等方式进行曲线拟合。粒子强化免疫测定(PEIA)法灵敏度较普通ITA法大为提高，且可以减少apo(a)多态性对Lp(a)测定值的影响。但胶乳的选择、胶乳与抗体的结合直接影响测定的精密度与试剂的稳定性。
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