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临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式测定操作非常简单一般涉及到标本的收集保存试剂准备加样温育洗板显色比色结果判断和结果报告及解释等方面其中任一步骤的不当都会影响测定结果且尤以加样温育和洗板等步骤为甚现分述如下 ： 一、临床标本的收集和保存 用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）有时因为特定的检测目的也用到唾液脑脊液尿液粪便等标本目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体肿瘤标志物激素特种蛋白细胞因子和治疗药物等对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响如可的松在早晨4～6点之间会有一峰值出现：生长激素促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放因此在测定此类激素时有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本以其中间值为测定值又如当从卧位变为站立位时血清中肾素活性将出现明显增高再如治疗药物的检测应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测用于传染性病原体的抗原和抗体肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面： （1）要注意避免出现严重溶血血红蛋白中含有血红素基团其有类似过氧化物的活性因此在以HRP为标记酶的ELISA测定中如血清标本中血红蛋白浓度较高则其就很容易在温育过程中吸附于固相从而与后面加入的HRP底物反应显色 。 （2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染一则细菌的生长其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰 。 （3）血清标本如是以无菌操作分离则可以在2～8℃下保存一周如为有菌操作则建议冰冻保存样本的长时间保存应在-70℃以下 。 （4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用从而引起假阴性结果此外冻融标本的混匀亦应注意不要进行剧烈振荡反复颠倒混匀即可 。 （5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时应离心沉淀后取上清检测 。 二、试剂准备 在临床实验室对试剂准备一般不太注意通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是在实验开始前将试剂盒先从冰箱中拿出来在室温下放置20分钟以上后再进行测定以使试剂盒在使用前与室温平衡这样做的目的主要是为了在后面的温育反应步骤中能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度以满足测定要求其次目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量此外当试剂盒以OPD为底物时则底物溶液应在反应显色前临时配制 。 三、加血清样本及反应试剂 在现在的ELISA商品试剂盒中血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快要避免加在孔壁上部不可溅出和产生气泡加样太快无法保证微量加样的准确性和均一性加在孔壁上部的非包被区易导致非特异吸附溅出会对邻近孔产生污染出现气泡则反应液界面有差异试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加除了要注意滴加的角度外滴加的速度也很重要滴加太快很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附从而引起非特异显色所以有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性下次测定为阴性往往就是上述加样及试剂的错误所致 。 |