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1.2.5化学发光系统的优化［2-3］由SapphireII不同浓度的增强剂和CSPD组成底物工作液，进行化学发光值（RLU）测定，进行底物工作液的优化.
1.2.6固相化抗体微孔板的制备［4］将抗AFP单抗用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释成1.0, 2.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0 μg/mL的包被浓度，按100 μL/孔的量加入包被板中，37℃包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L PBS (pH 7.4)37℃封闭2 h后晾干备用，确定包被选择最佳包被抗体工作浓度.
1.2.7正常人参考血清的确定用优化好的AFP化学发光定量试剂对800份健康人标本进行浓度测定，进行统计学分析，计算x+2 S，确定正常血清参考范围.
1.2.8化学发光免疫检测样品或标准品于相应孔分别加25 μL后，每孔再各加抗AFPALP75 μL，在震荡器上混匀1 min，置37℃恒温反应60 min. 洗掉游离成分，加入底物工作液50 μL，ALP催化底物脱磷酸酯,并发出463 nm的可见光，第10 min后测定各加样品孔的发光值RLU，并将数据用化学发光检测仪定量软件Luminoskan Ascent version 2.4.1软件进行定量分析.
2结果
2.1底物工作液的优化CSPD浓度为0.8, 0.4, 0.2, 0.1 mmol/L，SapphireII浓度为2.0, 1.0, 0.5, 0.25 g/L，分别用碱性磷酸酶1∶1000, 1∶10000在5, 10 min进行化学发光测定，记录不同增强剂和CSPD浓度的发光值，分别做出CSPD浓度RLU的曲线和SapphireIIRLU的曲线（图1）.
分析上述数据可得出以下结论CSPD在0.4 mmol/L以下时，RLU随CSPD浓度的变化而成比例变化，在0.4 mmol/L时达到平台，可能是底物浓度在0.4 mmol/L时使酶达到饱和. 增强剂SapphireII浓度对RLU的变化较复杂，在0.5~1 g/L时达到最大RLU，以后随着增强剂浓度的增加RLU反而下降. 确定底物工作液配制的浓度为：0.4 mmol/L的CSPD，增强剂SapphireII浓度为1.0 g/L.
2.2包被抗体浓度和酶标记抗体浓度的确定根据不同包被抗体浓度测定定量标准品的发光值，分别做出不同浓度包被抗体RLU的曲线（图2）. 包被浓度低时试剂的整体发光值也低，随着包被浓度的升高发光值也相应升高，在5.0 μg/mL时，发光值达到一个平台期（此时灵敏度达到一个平台期），选择标准曲线接近于直线时的包被浓度（5 μg/mL）为最佳.
2.3最低检出量平行测定20孔零值校准品血清，计算零值校准品RLU平均值（x）及标准差(S)，以x+2 S为测定值代入标准曲线方程中，求出其对应的浓度值，所对应的浓度值即为最低检出量为2.0 ng/mL.
2.4特异性检测分别测定与CEA(3 μg /mL)、铁蛋白(10 μg /mL)、人血清蛋白(200 g/L)、人丙种球蛋白(200 g/L)的交叉反应率，分别为≤0.15%, ≤0.04%, ≤2.5×10-8, ≤1.03×10-8.
2.5精密度测定AFP浓度为48.8~73.2 ng/mL的质控血清，重复检测3次,每次重复20孔，进行精密度测定，计算批内、批间平均变异系数分别为6.7%, 7.7%.
2.6正常人参考血清的确定对800份健康人血清检测进行统计，其中有95.4%的小于8.0 ng/mL,正常浓度只有上限而无下限，上限浓度去除5%的不可信区间，同时参考放免检测结果和目前公认的正常值范围，本检测方法的正常人血清应小于25 ng/mL.
2.7准确度取3份临床样本分别加入5 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL浓度的血清样品测试样品的加入回收率，对3份临床样本分别进行90%, 60%, 30%稀释计算稀释回收率，结果显示：加入平均回收率为98.6%，平均稀释回收率为102.3%.
2.8与进口试剂的比较［5］与bayer ACS: 180 全自动化学发光系统的AFP试剂共同对100份临床标本进行检测，二者所得的数值进行分析，其相关性有统计学意义（图3），LumiassayTM=1.2715×ACS: 180 -0.4126（n=100），（r=0.994, P<0.001）.
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