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3 同型半胱氨酸测定方法 同型半胱氨酸在血浆中以多种形式存在，标本的采集和处理方式显得非常重要。通常要求血液标本采取后要尽快分离血浆，制成无蛋白滤液，所有操作尽可能在4℃进行。无蛋白滤液在-20℃一般可保存数月。可以检测三种不同的同型半胱氨酸组分：还原型同型半胱氨酸，氧化型同型半胱氨酸即同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫化物占10％～20％，及结合型同型半胱氨酸（＞70％）。为了准确测定，在分析前应加入巯基试剂如二硫苏糖醇（DTT）、硼氢化钠等打开二硫键。 3.1 stabler等[7]首先报道气相色谱-质谱联用测定血浆中总同型半胱氨酸、总半胱氨酸和蛋氨酸。所用的仪器为HP5992B气相色谱-质谱仪，标本的处理过程包括：先加入三种内标[D.L-3,3,3′,3′,4,4,4′,4′-2H8]同型胱氨酸，[D.L-3,3,3′,3′-2H4]胱氨酸和L-[甲基-2H3]蛋白酸，然后加EDTA-Na2和β-巯基乙醇100℃15min，再以磺基水杨酸沉淀蛋白，上清液用离子交换柱预处理，氮气吹干后，用水重新溶解，进行衍处理后上样。气相色谱仪进行温度250℃，毛细血管柱箱温度180℃，以8℃/min速度升温至276℃，柱前端压力为26psi，以保留时间和质谱进行定性和定量。此法操作十分复杂，耗时长，仪器设备要求高，现除了在某些专门的实验进行测定外，普及很困难。 3.2 氨基酸分析仪和高效液相色谱法（HPLC）这两种方法都属色谱分离技术，HPLC由于其分离的高效率和检测方式灵敏而更常用一些。HPLC根据所用的色谱柱（反相柱或离子交换柱）、衍生方式（柱前或柱后衍生）、检测方式（紫外或荧光）又分为多种测定方法。其中以Fiskerstrand等[8]报道的方法较有代表性。血液标本以EDTA-Na2抗凝，0℃～4℃，2000g离心5min，碘基水杨酸沉淀蛋白质，上清液再与NaBH4溶液反应，还原二硫键，衍生化试剂为0.025mol/L的Monobromobimane，反应3min后以冰醋酸终止反应。20μl衍生后的样本进入一根150mm×4.6mm oDS柱。色谱柱预先以Ph3.5的硝酸铵缓冲液平衡，用含有乙腈的流动相进行梯度洗脱。用荧光检测器激发波长365nm，发射波长475nm检测。在此条件下，半胱氨酸、同型半胱氨酸的保留时间分别为8min和10.5min。衍生化和色谱条件稍加改变之后也可用于尿标本的测定。此方法灵敏度高，能分离、分析血液中存在的多种含硫氨基酸。 3.3 shipchandler[9]等报道了全自动的荧光偏振免疫测定（Fluorescence polarizationimmunoasssay FPIA）是通过竞争性免疫反应来测定血浆中同型半胱氨酸。血浆标本并不沉淀蛋白质，直接加入巯基试剂DTT，再加荧光素标记的同型半胱氨酸，标记的同型半胱氨酸分子较小，能在溶液中进行旋转运动，受偏光激发光照射后所发出的光不具有偏光性，荧光偏光度下降。当标记的同型半胱氨酸与相应抗体结合后，抑制了旋转运动，用偏光激发光照射，发出的荧光具有偏光性，荧光偏光度增大。样品中同型半胱氨酸与标记同型半胱氨酸竞争结合抗体，如果样品同型半胱氨酸越多，抗体与标记同型半胱氨酸结合就越少，游离标记物增多，荧光偏光度下降。此法需要专门的荧光偏光免疫检测仪。美国Abbot公司已有专门的FPIA同型半胱氨酸的检测试剂盒，配合使用Abbot imx系列FPIA分析仪，简便快速。 3.4 高效毛细血管电泳法分析测定血液中硫氨酸及代谢产物如同型半胱氨酸，同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫化物、蛋氨酸及胱硫醚等。高效毛细血管电泳法快速测定血液中的游离氨基酸已经报道[10]。我们在此研究基础上，摸索适宜的分离条件，同时分离、分析血液中多种含硫氨酸及其代谢产物，目前国内外均没有文献报道。与传统的反相高效液相色谱相比，高效毛细血管电泳是近年来发展的一项高效分离、分析技术，一般30min内即可完成一次分析，试剂消耗量少，重复性好，是一项十分有前途的分析方法。 |