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摘要 目的：了解丙型肝炎肝组织和血清中丙型肝炎病毒(HCV) rNA的含量及其相互关系。方法：采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测24例慢性丙型肝炎患者肝组织和血清HCV rNA含量。结果：肝组织中HCV RNA含量(108至1012拷贝/克)与血清病毒含量(105至109.2拷贝/毫升)呈显著正相关(P＜0.01)。每克感染肝组织HCV rNA含量高于每毫升血清的102至104拷贝。慢性活动性肝炎肝组织和血清中HCV rNA含量显著高于慢性迁延性肝炎。动态结果显示，血清HCV RNA含量与ALT水平呈显著正相关。结论：提示慢性丙型肝炎病变程度与肝组织中HCV rNA含量有关，血清中HCV RNA含量可作为监测肝内HCV RNA复制程度的一个指标。 关键词：肝炎病毒 丙型 定量聚合酶链反应 活组织检查 血清HCV RNA定量检测可直接反映丙型肝炎(丙肝)的病毒血症水平，对预测和评价干扰素治疗效果有重要作用［1］。国外研究报道HCV血症水平与肝组织中HCV复制活跃程度相关［2］，国内有关研究报道甚少。为了解丙肝肝组织中HCV rNA含量变化，我们采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测24例慢丙肝患者肝组织中HCV rNA含量，并与血清中HCV RNA含量的关系进行了探讨。 材料和方法 一、研究对象 24例慢性丙肝(慢丙肝)均为1992年10月至1996年12月我院住院患者，平均年龄40.3(18～60)岁，其中15例为男性，9例为女性。所有病例进行肝组织穿刺活检，病理诊断为慢性活动性肝炎(CAH)14例，慢性迁延性肝炎(CPH)10例。以上病例血清抗-HCV和HCV rNA阳性，ALT升高持续半年以上，除外甲、乙、丁及戊型肝炎病毒感染。有输血史者16例。5例患者接受干扰素治疗6个月，其中2例进行治疗前后两次肝活检。取部分肝组织冻存于-70°C备用，同时收集血清标本，置-20°C保存，统一检测。健康献血员血清为阴性对照。 二、肝组织和血清HCV RNA提取 按异硫氰酸胍一步法［3］提取RNA。取冷冻肝组织20毫克，在裂解溶液中剪碎，研磨匀浆，然后提取RNA。所有血清和肝组织标本与阴性对照标本同时进行RNA提取。 三、HCV RNA定量检测 采用荧光定量PCR技术［4］。已知量的HCV RNA阳性标准为纯化的病毒RNA。引物序列：在HCV rNA的5′末端非编码区内选择内、外引物。将抽提RNA溶于DEPC溶液中，待溶解后即刻取上清液5微升进行逆转录反应合成cDNA，然后分别加入不对称扩增引物和信号扩增引物等，进行荧光PCR检测。同时将已知量的纯化HCV rNA同步进行PCR扩增，建立外参标准曲线。PCR结束后，应用计算机软件即可算出样品中HCV rNA的含量。每次实验均设空白、阳性、阴性及峰值对照，每份标本取两孔均值计算结果。 结果 一、慢丙肝患者肝组织和血清中HCV RNA的含量 见表1，结果显示血清HCV RNA含量在105至109.2拷贝/毫升之间，肝组织HCV rNA含量在108～1012拷贝/克。对19例未接受抗病毒治疗的慢丙肝患者进行分析，结果显示CAH肝组织及血清中HCV rNA的含量均显著高于CPH(P＜0.01)。 表1 慢丙肝患者肝组织和血清HCV RNA含量结果 病例 ALT(U/L) 组织学诊断 HCV RNA含量 注：血清ALT测定的时间与肝活检一致；*：干扰素治疗停药后结果；**：随访半年后结果 二、肝组织和血清中HCV RNA含量的相互关系 肝组织HCV RNA含量明显高于血清中的含量，每克感染肝组织HCV rNA含量高于每毫升血清的102至104拷贝。相关分析显示，肝组织与血清中HCV rNA含量呈显著正相关(r=0.85,P＜0.01)。1例(病例23)干扰素持续有效患者，在治疗结束时检测血清及肝组织中HCV rNA均阴性，随访一年ALT仍在正常范围。而另1例部分有效的患者(病例24)，治疗结束时ALT复常，血清HCV rNA阴转，而肝组织HCV RNA仍阳性(其含量较治疗前显著下降)，随访半年后ALT升高，血清HCV rNA阳转。 三、丙肝患者血清HCV RNA含量与ALT水平的关系 对19例未接受干扰素治疗慢丙肝患者进行血清HCV RNA含量动态观察(至少4次以上)，同时检测血清ALT变化，对以上两指标进行相关分析，结果显示血清HCV rNA含量与ALT水平呈显著正相关(r=0.740,P＜0.01)。 讨论 丙肝发病机制十分复杂，至今尚未完全阐明。HCV是嗜肝病毒，主要在肝内复制，肝内HCV rNA的含量可能与肝炎病情轻重有关［5］。我们研究发现，CAH患者血清和肝组织中HCV rNA水平明显高于CPH，结果提示进展性肝病感染细胞的数量可能增多，或者HCV基因复制活跃，且HCV对肝细胞有直接细胞毒作用，与国外报道相似［6］。本研究显示，慢丙肝患者肝组织中HCV rNA含量显著高于血清中的含量，每克感染肝组织HCV RNA水平高于102～104拷贝/毫升，相关分析显示血清与肝组织中HCV rNA含量呈显著正相关，这一结果表明循环中HCV病毒颗粒主要从肝组织中释放入血液中的，尽管肝外组织如某些淋巴细胞等也能进行HCV复制，但仅占极少一部分［7］。因此，检测肝组织HCV rNA含量更能准确反映HCV在人体内的复制程度。 干扰素治疗能有效抑制HCV复制，降低血清转氨酶，促进肝细胞恢复［8］。我们研究发现，血清中HCV rNA阴性并不一定表明HCV从患者体内完全清除。部分有效患者在干扰素治疗期间，肝内HCV被抑制，复制程度降低或处于静止期，没有病毒颗粒释放入血液，使血清HCV rNA不能检出。停药后，HCV重新复制活跃，致使在随访期间，血清中HCV rNA再次出现，转氨酶反跳。而持续有效的患者则血清及肝组织中HCV rNA均阴性。所以在评价药物抗病毒疗效方面，检测肝组织HCV rNA含量有重要的参考价值。 本研究发现慢丙肝血清HCV RNA含量与ALT水平呈正相关，表明肝细胞损害程度与病毒血症水平有关，因此，定量检测血清和肝组织中HCV rNA含量对认识丙肝的发病机制及评价干扰素疗效有重要意义，血清中HCV rNA含量可作为监测肝内HCV RNA复制程度的一个指标。 广州市第八人民医院传染病研究所 参考文献 1 Yamada G, Takahashi M, Tsuji T. Quantitative HCV RNA and effect of interferon therapy in chronic hepatitis C. Dig Dis Sci, 1992,12:1926-1927. 2 Nakagawa H, Shimomura H, Hasui T, et al. Quantitative detection of hepatitis c virus genome in liver tissue and circulation by competitive reverse transcription polymerase chain reaction. Dig Dis Sci, 1994,39:225-233. 3 Chomczynski P, Sacchi N. Singl-step method of RNA isolation by acid guanidinium shiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal biochem,1987,162:156-159. 4 张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV dNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997，15：24-27. 5 Fong Tl, Shindo M, Feinstone SM, et al. Detection of replicative intermediates of hepatitis C. Viral RNA in liver and serum of patients with chronic hepatitis C. J Clin Invest, 1991,88:1058-1060. 6 Kumar U, Thomas HC, Monjardino J. Serum HCV RNA levels in chronic HCV hepatitis measured by quantitative PCR assay; correlation with serum AST. J virol Methods, 1994, 47:95-102. 7 Shimizu YK, Iqamoto A, Hijikata M, et al. Evidence for in vitro replication of hepatitis C virus genome in a human T-cell line. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:5477-5481. 8 Hagiwara H, Hayashi N, Mita E, et al. Detection of hepatitis C virus RNA in serum of patients with chronic hepatitis C treated with interferon. Hepatology,1992,15:37-41. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||