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3. 质量控制 鉴于基因诊断操作较为复杂并要求严格质控,2005年末,卫生部临床检验中心已经对全国近500家三级医院的PCR实验室进行了认证和评估,并针对国内HBV核酸诊断试剂包装小、效期短、批号更换频繁的现状,每年开展2次室间质评。这在一定程度上提高了HBV DNA定量检测的水平,但对一个实验室每年2次的室间质评显然不能保证结果的准确性,对实验报告而言室内质控更为重要。
PCR实验室室内质量控制旨在监测和控制实验室结果的精确度,以决定HBV DNA定量检测的报告能否发出。以下几个要点有助于完善室内质控:①质控值在均数±3SD以上的检测数据为质控失控,不能发送检测报告,立即查找原因,如质控品失效、污染等。②对于质控值在均数±2SD之内的数值变化应该注意规律,如果出现质控曲线的定向“漂移”现象,连续几天质控数值向一侧偏离,应该及时核查质控血清效期、试剂效期。③每个试剂批号的室内质控曲线分析、每个月室内质控曲线分析,有助于早期发现室内质控可能出现的问题。④制定规范并严格执行标准操作规程。
4. HBV cccDNA检测 HBV共价闭合环状DNA (cccDNA) 是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的合成模板,是HBV持续感染的关键。近年来有关HBV cccDNA研究逐渐增多。但迄今为止,国内普遍应用的是实时荧光PCR定性试剂,尚无诊断试剂用于临床。
HBV耐药检测
1. 原理及方法 目前多数临床资料认为,乙型肝炎患者拉米夫定治疗过程中HBV出现YMDD变异是HBV 耐药的转折点,因此YMDD变异检测已渐趋普遍。主要的检测方法有:①PCR扩增法:PCR扩增-限制性酶切片断多态性分析(PCR-RFLP)是目前国内实验室最常用的YMDD变异、rtA181V阿德福韦酯耐药、BCP区变异位点的检测方法。实时荧光PCR扩增是近期国内应用较多的HBV耐药检测方法。②基因芯片分析:包括流体芯片技术、探针杂交技术,主要通过逆向斑点杂交技术实现对变异位点的检测。③焦磷酸测序法:对YMDD突变质粒及血清标本的重复性及可靠性检测显示,质粒标准品的突变检出率及重复率为100%,而血清标本为98.8%。④基因克隆与测序:采用特异性引物对YMDD所在目的片断进行克隆后测序,通过与标准株的比较识别变异位点。这是所有检测方法中最为客观的检测方法,但操作复杂、成本高、耗时长是该方法的主要缺陷。www.xf366.com
2. 质量控制 上述核酸检测的室内质控目前主要采用内标技术,除少数实时荧光PCR技术试剂外,多数试剂目前国家药物食品管理局尚未批准用于临床检测,标准品制备尚未规范化管理,室间质评因此未能进行。
3. 耐药结果解读 尽管目前多数学者认为YMDD变异是确定核苷类似物停药的基本参考指征,但近期韩国学者对740例接受拉米夫定治疗的乙型肝炎患者HBV编码蛋白MALDI-TOF质谱分析显示,整个治疗过程中均可检测到YMDD变异的存在。研究者认为低水平YMDD变异的存在并非预示HBV DNA复制的再次活跃,与野生株相比,5倍的YMDD变异则高度提示HBV DNA复制的再次活跃。研究提示,对耐药位点的检测结果需要充分考虑HBV准种对检测结果的影响。
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