5. 荧光蛋白染色法:
2000年,Grossart等报道了一种荧光蛋白染色法该方法是在玻片上加10μl活细菌液体培养物,再加0.5μl荧光染色剂(nanoOrange),然后加30%聚乙烯吡咯烷酮10~20μl,盖上盖玻片,10~15min后使用放大倍数×1250,激发波长490nm,发射波长520 nm的落射荧光显微镜(epifluores cence microscopy)观察。研究中共检测了37株细菌,其中有动力的6株细菌未观察到鞭毛。这种新方法不适合于在临床微生物实验室常规开展,因为结果观察时必须借助特定的设备,细菌培养必须使用液体培养基,其可靠性还有待进一步验证。
综上所述,无论是碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法,还是传统镀银染色法都无法克服试剂不稳定这一最大的缺点。结晶紫法虽然试剂比较稳定,但染色效果却不理想。谷海瀛发明的细菌鞭毛镀银染色法操作简便、快速、试剂稳定、重复性好,可以作为实验室常规鞭毛染色方法推广应用。
二、细菌鞭毛染色应用意义
细菌鞭毛是细菌的运动器官,幽门螺杆菌能够从强酸性的胃内腔穿过胃上皮细胞上的黏液层达到胃上皮细胞的中性环境,这就是鞭毛运动作用的很好例证。
细菌分类学常将细菌的动力测定作为鉴定细菌的重要试验,动力试验常用悬滴法、压滴法和半固体培养基法。但对于弱动力菌株悬滴法和压滴法的观察结果常为阴性,而使用半固体培养法可以得到阳性结果,谷海瀛发现,使用MTT半固体培养基更容易观察菌株的弱动力,但至少要培养72h才能观察到。Rhodes等已论述每株细菌每一菌体细胞上的鞭毛数量是不恒定的,同一株菌可以观察到甚至5种以上不同鞭毛数的菌体细胞,例如大肠埃希菌在鞭毛涂片染色后,可以发现菌体鞭毛数量1~10根,由于菌体细胞的鞭毛数量的多样化,可以看到多种鞭毛分布的菌体细胞,这种现象可能是与鞭毛基因表达有关,也可能与鞭毛脱落有关。
通过鞭毛染色,可以观察到鞭毛形态、数量和鞭毛在菌体分布的位置,鞭毛数量和在菌体上的分布位置是鉴定细菌的重要依据之一,根据鞭毛的这些特征,可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。
单端极鞭毛(monotrichous):在菌体的一端只有1根鞭毛,例如绿脓假单胞,但这个概念可能要改变,敏捷食酸菌(acidovorax facillis,曾称敏捷假单胞)、德氏食酸菌(acidovorax delafieldii,曾称德氏假单胞)、缺陷短波单胞菌(brevundimonas diminuta,曾称微小假单胞)、泡囊短波单胞(brevundimonas vesicularis,曾称泡囊假单胞)、栖稻假单胞(pseudomonas oryzihabitans)、腐败希瓦菌(shewanella putrefaciens,曾称腐败假单胞)。这些菌曾均被描述为单端极鞭毛菌现在证明这些菌均为一端有1~2根鞭毛,现可以重新定义这是单端双毛菌(bitrichous)。
丛鞭毛(lophotrichous flagella 或 multitrichous flagella)菌体细胞的一端或两端鞭毛数大于2,例如恶臭假单胞菌。
周鞭毛:鞭毛多少有些均匀分布于菌体细胞表面外周,由于文献没有定义鞭毛数,可以提出新的定义,如果菌体细胞鞭毛数多于3,且几乎均匀分布于该细胞表面,即为周鞭毛,例如肠杆菌科细菌。
侧鞭毛:分为单侧鞭毛(lateral flagellum)和多侧鞭毛(lateral flagella),单侧鞭毛就是菌体细胞侧边长有1根鞭毛,谷海瀛首次发现非O1型霍乱弧菌有单侧鞭毛。国内外文献提到的侧鞭毛(lateral flagella)系指多侧鞭毛,即菌体细胞侧边分布的多根鞭毛,形态上侧鞭毛和周鞭毛难以区分。9版伯杰手册在革兰阴性需氧杆菌、微需氧杆菌和球菌Group4的章节中,将Subgroup 4a 80个菌属进行列表,把有鞭毛的细菌分为两类,即单端鞭毛菌和侧鞭毛菌。
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