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细菌鞭毛染色方法及其应用(2)

时间:2010-11-09 11:17来源:幸福检验 整理 点击:
 
3. 维多利亚蓝B法:
 
  1990年由Inoue等报道日本制药株式会社Shionogi Seiyaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸和硫酸钾铝,染色约需7min。该试剂保存期约为6个月,关于其染色效果虽然有过一篇文献评述,但却没有采用评分法进行评价,很难判断其染色效果。
 
4. 镀银染色法:
 
  1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法,建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂和银染剂。
 
  媒染液:10%单宁酸10 ml加5 ml饱和硫酸钾铝水溶液,再加1 ml苯胺饱和水溶液形成沉淀,通过摇动又能重新溶解,加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液,稳定10 min后使用。
 
  银染液:配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml备用,再缓慢加入浓氨水(比重0.880)使形成的沉淀刚好重新溶解,最后把备用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入,直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止,避光保存,可稳定数周。
 
  用媒染液染片3~5min,蒸馏水充分洗涤后,再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾,染色3~5min。由于Rhodes镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁锁,所以1965年Blenden等改良了细菌鞭毛镀银染色法的配方。试剂A:100 ml蒸馏水中加入5 g单宁酸,1.5 gFeCl3,15%福尔马林2 ml,1%NaOH溶液1 ml。试剂B:使用2% AgNo3,其他同于Rhodes,但试剂不稳定,要求在4h内使用,并用要用氨水调pH至10。试剂A染片2~4min,试剂B染色30 s,不需加热。由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物,并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片,未采用评分法评价镀银染色方法。因此1977年,West等对镀银染色法进一步改良,制备涂片时直接使用血平板,评价染色效果首次使用5分制,通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。
 
  试剂配方:媒染液为饱和硫酸钾铝水溶液25 ml,10%单宁酸50 ml,5%FeCl3水溶液5 ml,5℃保存,染色液配制同Rhodes,但需避光5℃保存。
 
  媒染液染片4min,银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽,染色4min。同时West等还对使用不同培养基进行染色效果评价,包括半固体动力培养基、血琼脂平板、TSA(trypticase soy agar)斜面,其中半固体动力培养基和TSA斜面25℃,培养18~24h;血琼脂平板35~37℃,培养18~24h。评价结果血琼脂平板35~37℃,培养18~24h不适于细菌鞭毛染色,而半固体动力培养基和TSA斜面25℃,培养18~24h适合于细菌鞭毛染色,同时也证明了使用福尔马林处理标本制备涂片并不能有效阻止鞭毛脱落。由于镀银染色法媒染液不稳定,需避光5℃保存,1992年Porter等继续改良该方法,其试剂配方同West等的方法,只是媒染剂避光室温可保存数月,延长媒染剂染色时间为8 min,染色液不需加热,只染30 s,制备涂片程序略有不同。使用TSA平板,36℃培养24h,但遗憾的是Porter等只使用了1种细菌(奇异变形杆菌)进行研究。于是1994年Finegan等进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果,并使用4种细菌(绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌),用trypitcase soy肉汤及其琼脂平板,26℃培养24h。试剂配方仍不变,媒染液放置1、2、4、8、16周后进行染色,媒染液染色8 min,银染液染色30~60 s,不需加热。这4种细菌均染色成功,从而证明媒染液可至少放置16周。
 
  2002年谷海瀛发明了一种新的细菌鞭毛镀银染色法。该法将媒染剂分为A、B两种。A液为酸化FeCl3溶液,B液为15%单宁酸,含甲醛1 ml,用时A、B液等量混合,轻微加热,染片40s,再用银染液涂片加热至微冒蒸汽,染色10 s。通过对19个属,34个种,228株细菌进行鞭毛染色,应用West等的染色效果评价方法进行评价。血琼脂平板培养平均每株菌获得4.7分,肉汤培养平均每株菌获得4.6分,其中100株非发酵菌在血平板培养获得满分5分。重要的是这种方法不仅染色效果好,而且解决了试剂稳定性差的问题,此种试剂常温下至少可保存1年。
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