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　　PCR扩增得到的ssrB基因上游同源片段F1和下游同源片段F2经琼脂糖凝胶电泳检测，F1大约为570 bp， F2大约为347 bp，与预期相符。F1和F2片段经Sal Ⅰ酶切T4连接酶连接后进行TA克隆，对筛选到的阳性克隆进行DNA测序分析，结果显示F1-F2序列与缺失ssrB基因中270 bp的伤寒沙门菌野生株GIFU10007的原序列一致。将F1-F2片段成功克隆至自杀质粒后，提取带有目的片段的自杀质粒电转化导入野生株，使其在含有5%蔗糖的LB平板上与基因组DNA进行同源重组。经PCR鉴定，获得了连续4次传代均只扩增出缺失270 bp的小片段的菌株，即为稳定的完全重组的伤寒沙门菌ssrB基因缺陷株(图2)。

　　(a) PCR扩增F1、F2。M：DL2000 DNA 标准参照物;1：F1片段;2：F2 片段。(b) 重组自杀质粒鉴定。M： DL2000 DNA 标准参照物;1：PCR扩增F1- F2; 2：酶切重组自杀质粒。(c) 重组菌第4次传代后PCR观察结果。M： DL2000 DNA 标准参照物;1-8：PCR扩增重组菌F1- F2; 9： PCR扩增野生株F1- F2。图2 伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株的制备

　　2.2 伤寒沙门菌野生株和ssrB缺陷株氧应激早期基因表达的差异

　　将伤寒沙门菌野生株和ssrB基因缺陷株在等渗环境培养3h后，在培养基中加入H2O2进行氧应激， 15 min后，提取细菌总RNA，利用伤寒沙门菌全基因组芯片进行表达谱分析。芯片结果显示，与野生株相比，ssrB基因缺陷株有68个基因表达下调，有20个基因表达上调。

　　2.3 qRTPCR验证基因芯片分析结果

　　从芯片表达谱中选取orgA，prgK，prgH进行qRTPCR分析。结果显示orgA基因表达下调约10倍(t=115.2， P<0.001)，prgK基因表达下调约2倍(t=39.2， P<0.001)，prgH基因表达下调约1.5倍(t=55.8， P<0.001)。结果与芯片分析所得的表达差异基本一致，表明芯片分析结果可靠(图3)。图3 qRTPCR验证基因表达(n=9)

　　2.4 伤寒沙门菌野生株和ssrB基因缺陷变异株侵袭HeLa细胞能力差异

　　在基因芯片结果中下调的orgA、prgK和prgH基因均为伤寒沙门菌与侵袭相关的毒力基因，为了验证ssrB基因是否与伤寒沙门菌的侵袭性相关，选取了HeLa细胞进行伤寒沙门菌侵袭上皮细胞的体外实验。结果显示，ssrB基因缺陷变异株的侵袭能力仅为野生株的34.6%(t=228， P<0.001)，表明ssrB基因能促进伤寒沙门菌侵袭上皮细胞(图 4)。图4 伤寒沙门菌侵袭HeLa细胞的结果(n=6)

　　3 讨 论

　　目前研究表明，ssrAB双组分调控系统位于伤寒沙门菌SPI2上，可以调控SPI2以及位于SPI2以外的多个基因。ssrAB双组分调控系统也受多个上游调控因子的调控，例如，PhoPQ双组分调控系统，OmpREnvZ双组分调控系统以及SlyA， 其中OmpREnvZ双组分调控系统对SsrAB的调控是通过OmpR直接结合于ssrAB的启动子区域对ssrAB的转录进行调控[11-15]。这些研究结果提示，渗透压、酸碱度、镁浓度等多种环境因素可以影响ssrAB的表达，显示ssrAB对其下游基因的调控也有复杂的机制。

　　本组研究结果显示，与野生株相比，伤寒沙门菌ssrB基因缺陷株在氧应激早期共有88个基因表达发生变化，其中，表达量下调的基因有68个，表达量上调的基因有20个。我们选取了表达下调的orgA，prgK，prgH基因用qRTPCR进行验证，结果与芯片分析结果一致，进一步证明此次芯片结果可信。dcuA， dmsA， dmsB等是在缺氧条件下发挥作用的基因，芯片结果显示ssrB能负性调控这些基因的表达，提示ssrB在氧应激条件下能有效地调控基因，充分利用细胞内的资源应对氧应激。

　　伤寒沙门菌野生株和ssrB基因缺陷株侵袭HeLa细胞的体外实验显示，ssrB基因缺陷变异株的侵袭能力仅为野生株的34.6%，表明ssrB基因在伤寒沙门菌侵袭上皮细胞的过程中发挥重要作用，是伤寒沙门菌重要的毒力因子之一。