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【摘要】 目的：探讨我院临床分离多重耐药铜绿假单胞菌的β-内酰胺酶相关基因及Ⅰ类整合子(intⅠ1和qacE△1-sul1)的携带情况，为临床抗感染治疗和控制医院感染提供依据。方法：采用K-B法对临床分离的铜绿假单胞菌进行药敏试验，选出34株多重耐药菌株，用PCR法检测其相关耐药基因16种。结果：在34株多重耐药铜绿假单胞菌中共有13种耐药基因阳性，阳性率较高的为qacE△1-sul1、oprD2缺失、blaTEM。结论：多重耐药铜绿假单胞菌可同时获得多种耐药基因，临床应根据药敏结果选择用药，以减少耐药菌株的产生，控制院内感染。 【关键词】 铜绿假单胞菌;耐药基因;β-内酰胺酶;Ⅰ类整合子
[ABSTRACT] Objective： To explore the resistance gene and prevalence of beta-lactamas and classⅠintegron of clinical isolates of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa (MDRPA) in our hospital， and provide evidence for clinical anti-infective therapy and control the nosocomial infection. Methods： Antimicrobial susceptibilities of the Pseudomonas aeruginosa isolates were detected by Kirby Bauer method. Out of 34 collected MDRPA strains， 16 kinds of resistance genes were detected by polymerase chain reaction (PCR) method. Results： Thirteen kinds of resistant genes were detected as positive for the 34 strains. Relevant higher positive rates were observed for qacE△1-sul1、oprD2 defect and blaTEM. Conclusions： Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa have several kinds of resistant genes. Antibiotics should be used rationally according to antimicrobial susceptibility in order to control the development of multidrug bacteria and nosocomial infection.
[KEY WORDS] Pseudomonas aeruginosa;Resistant gene ;Beta-lactamase ; Class1integron
铜绿假单胞菌(PA)是医院分离率最高的条件致病菌。近年来，随着对3类或3类以上抗菌药表现耐药的多重耐药(MDR)的PA不断增加，给临床抗感染治疗带来了极大困难。PA的耐药机制非常复杂，包括产生多种β-内酰胺酶、氨基糖苷类抗菌药物修饰酶、外膜孔蛋白D2 (OprD2)缺失、外排机制等[1-3]。为了解我院临床分离的铜绿假单胞菌耐药基因，我们对34株多重耐药PA菌的表型及其β内酰胺酶基因及Ⅰ类整合子进行了检测与分析。
1 材料与方法
1.1 菌株来源及细菌鉴定
所有菌株分离自江苏大学附属医院2007～2009年临床送检的痰液、尿液、脓液等标本，共34株。细菌的分离与鉴定参照《全国临床检验操作规程》第3版，并经VITEK GNI+鉴定卡鉴定。标准菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853，大肠埃希菌ATCC25922。
1.2 药敏试验及药敏纸片
采用K-B法对临床分离的铜绿假单胞菌进行15种药敏试验。根据CLSI 2009年版标准规定的临界值判读药敏结果。其中氨曲南(AZM)、头孢哌酮(CFP)、头孢哌酮/舒巴坦(C/S)、左氧氟沙星(LVF)、哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(P/T)、头孢他啶(CAZ)、阿米卡星(AMK)、庆大霉素(GEN)、妥布霉素(TOB)、环丙沙星(CIP)、复方新诺明(SXT)、奈替米星(NET)购自北京天坛药物生物有限公司，亚胺培南(IMP)购自英国Oxoid公司，头孢吡肟(FEP)购自美国BD公司。水解酪蛋白(MH)琼脂，购自杭州天和微生物有限公司。
1.3 耐药基因检测
1.3.1 模板DNA提取
挑纯培养细菌菌落少许置入50 μL灭菌水中，置100 ℃水浴10 min， 8 000 r/min 30 s，上清液即为DNA模板液。
1.3.2 基因扩增
oprD2基因热循环参数为93 ℃预变性3 min→93 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，最后一个72 ℃延伸5 min，共循环35周期。其余基因热循环参数为：93 ℃预变性3 min→93 ℃ 60 s→55 ℃ 60 s→72 ℃ 60 s，最后一个72 ℃延伸5 min，共循环35周期。纯水为阴性对照。经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。PCR方法引物序列见表1[4-5]。
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