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1 艰难梭菌简介 艰难梭菌又叫“艰难梭状芽孢杆菌”，最早发现于上世纪30年代，是造成医院感染和住院病患腹泻的常见细菌。普通人群中约有3%的人的肠胃中都有这种细菌，在正常情况下，该细菌受制于人体内的其他细菌，不会危害人体健康。但对于长期或是大量服用抗生素的病人而言，这种细菌是可怕的，甚至是致命的。这是由于药物破坏了人体肠胃中各种菌类之间的平衡，所以容易导致“艰难梭菌”感染。就“艰难梭菌”本身而言，其致命性并不高，在0.6%到1.5%之间，但由于感染该细菌通常会伴随伪膜性结肠炎的出现，一旦出现这种情况，死亡率就会猛增到35%到50%。而且，与所有的细菌一样，“艰难梭菌”会通过突变产生新的变种，而这些变种细菌的毒性和对人体的危害性、致命性通常也更强。
2 艰难梭菌的传统检测方法
所有艰难梭菌菌株皆表达抗原谷氨酸脱氢酶，但是艰难梭菌分为产毒菌株和不产毒菌株两种。仅产毒菌株分泌毒素A和毒素B。毒素A和毒素B都可以导致艰难梭菌相关疾病的发生。艰难梭菌的检测主要是通过对疑似病例的粪便中毒素的检测完成[1]。直接粪便毒素测定包括细胞毒素测定（CTA）和酶免疫测定（EIA）[2]。CTA中毒素B的检测被认为是艰难梭菌检测的金标准[3]。CTA涉及到将培养的细胞暴露到有或者没有抗毒素存在的排泄抽提物中。如果排泄物样本是艰难梭菌阳性，则对没有经过抗毒处理的培养细胞有毒害作用[4]。
艰难梭菌也可以通过在厌氧条件下培养而被检测。这种方法具有很高的灵敏度，但是也很耗费时间，需要超过三天的时间。另外，这种方法不能区分产毒菌株和非产毒菌株。利用EIA对细菌培养分离株进行进一步测试，主要是鉴定艰难梭菌菌株是否产毒 [5]。
传统实验室的C.diff测验都是根据以下三种方法中的一种或者结合几种进行的：细胞培养测定中的细胞毒素检测； 艰难梭菌毒素A、肠毒素、或者毒素A和毒素B的酶免疫测定（EIA）检测； 艰难梭菌的厌氧培养。[6]
2.1 细胞培养测定中的细胞毒素检测
过滤的粪便抽提物加到微量滴定板上处于生长的健康的单层细胞中，培养48h。如果样本中存在细胞毒素（一般是艰难梭菌毒素B），将会导致单层细胞聚集，脱离板（称为细胞病变效应，CPE）。非特定细胞毒素的鉴别是通过加入向第二个孔（孔内有病人的粪便抽提物）加入特定的抗毒素（实际上是培育一种相似的微生物C. sordellii）。只有起始的CPE是由于艰难梭菌毒素B引起的，在相应的孔中抗毒素才会阻止CPE。一般认为，细胞毒素中和（CTN）测定是实验室检测中最灵敏和精确的，但是存在两个主要的缺点：出结果的速度不够快，从而影响了及时的临床诊断；这种方法需要专业的技术和连续的组织培养[7]。
2.2 艰难梭菌毒素A、肠毒素、或毒素A和毒素B的酶免疫测定（EIA）检测
一些商业产品通过检测在主要存在于有生长力的艰难梭菌细胞的一种蛋白质，叫谷氨酸脱氢酶（GDH），结合毒素检测。因为粪便中的毒素易分解，特别是如果在转移到实验室的过程中经过耽误，毒素测验很可能会错误地成阴性，然而GDH是相当稳定的，通常可以表明微生物的存在。这种方法的缺点包括缺乏灵敏性，一些菌株毒素的改变使得不能被商业化产品检测出来；一些无毒素的艰难梭菌也可分泌出GDH（假阳性结果）；一次进行这些检测的费用；如果EIA测验是成批进行以提高工作流程和成本效益，将会使周转时间延长。
2.3 艰难梭菌的厌氧培养
培养是所有检测中最灵敏的方法。但是必须进行二次检测以判断产物毒素是否存在，因为非毒性菌株还是比较常见的。这就延长了出结果的周转时间。另外，艰难梭菌的芽孢是极其坚固的，但是有生长力的形式却比较脆弱，必须维持厌氧环境以使其恢复生长。一种特殊的介质——环丝氨酸-头孢西丁果糖琼胶（CCFA），必须在厌氧环境下储存并培养48h，以达到最佳的恢复。因为培养技术的困难和结果输出的延迟，在相对很少的检测性实验室中会对艰难梭菌进行培养。早先的研究区分疾病通常包括在内镜检查术下宏观观察粘膜的外观，通过组织病理学比较（假膜是由剥落的细胞组成的白色或者黄色粗糙的物质构成），或者在结肠粘膜的活体组织上观察到的的微观病变。目前这种有扩散性的检测在今天已经几乎不被利用了，实验室测验是检测的主要模式。这使得测验和标准的选择至关重要。
最近已经有文献报道了采用两步方法后的更好的结果：对微生物本身非常灵敏的检测，首先利用EIA检测GDH，紧接着对细胞毒素和中和的二次检测。因为在所有病人的粪便标本中的艰难梭菌，对GDH的快速检测将都是阳性的，不管毒素的性质是否已经在运输过程中分解，这种方法是最灵敏的。粪便在其最初的检测中被认为是阴性的，即可立刻被报告时阴性的。因为第一个样本是最有价值的。看护者可以进行其他的检测方法，并使得改变抗生素疗法决定的立即必要性得到阻止。实验室必须继续进行细胞毒素测定，这使得周转时间增加，或者培养和毒素测验的时间增加。然而，两步方法是最有效的。
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