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酶检测的一个重要条件是每个RNA分子仅能切割一次，因为二次切割将无法反映其天然状态。所有类型的RNA分子切割条件很少相同，并且不能确定单击动力学是否完成。Kertesz等，过假定碱处理导致了5′-OH片段，且这种5′-OH片段可避开深度测序分析而对非特异性切割进行间接控制。Underwood等在分析中就间接考虑了控制，因此数据在更坚实的基础上(图1)。
Underwood等采用的方法具有的明显优势，作者提供了一个软件可将图形序列读值转化为一种可被加州大学圣克鲁斯分校(UCSC)基因组浏览程序识别的格式序列，也可通过输入到一种RNA预测软件中得到与实验数据和能量最小化计算结果相容的二级结构结果。
将S1或P1单链核苷酸与RNase V1结合使用提供了互补的信息，并对RNA结构分析添加了限制。这些酶探针通常对空间位阻敏感，因此不会生成RNA结构的原子信息。在未来研究人员有可能利用化学探针提供更详细的信息，并使其在体内容易使用
虽然这两种方法都有着相同的缺点即由于需从细胞中抽提RNAs并在缓冲液中复性从而有可能生成体外结果，然而它们打开了多个研究方向。其衍生的一个生物体基因组上的RNA结构动力学完整图像对应着广泛的环境条件例如温度、pH值或其他。利用平行测序，并通过在原核或真核细胞中添加各种调控因子(RNA结合蛋白、代谢产物或调控反式作用RNA)的方法可对全RNA的结构变化进行监控。这一实验还将有助于鉴别靶向调控因子的整套原始RNA。现在在活细菌中或在真核细胞无生命或有生命压力下对对应环境变化的RNA结构动力学进行完全检测已经成为了可以达成的目标。而那样的一种“RNA结构组”将是在活生物体内建立以RNA为基础的调控和反应性网络所必需的。
12月份出版的《自然—方法学》刊登了一篇文章，描述了一种高通量RNA结构测定方法——“片段化测序”法(Fragmentation sequencing ，FragSeq)。相关研究由美国加州大学圣克鲁兹分校霍华德·休斯医学研究院教授索菲·萨拉马(Sofie Salama)所领导的课题组完成。
RNA对基因表达和基因组稳定性的调控作用成为近来研究的热点，而弄清RNA二级结构是理解RNA功能的第一个必要步骤。测定非编码RNA结构的经典方法是化学法和酶法，但是它们一次只能测定一个RNA分子，这种方法不仅费力而且对技术要求高。FragSeq法却可以在整个转录组水平同时对大量RNA进行结构测定。
该研究利用核酸酶P1将小鼠RNA进行片段化，得到20–100-nt 大小片段;之后在片段的5"-PO4和3"-OH端分别加上接头，通过逆转录和PCR扩增之后，构建FragSeq文库并对其进行深测序。为了保证文库片段均是由核酸酶P1剪切产生，萨拉马等设置了两个对照组：一组RNA不使用核酸酶P1处理来估算由内源降解产生5"-PO4基团的片段数，另一组则多加了T4连接酶处理RNA，以此来计算不产生5"-PO4基团的片段数。通过凝胶电泳分离出目标片段。最后萨拉马等利用一种软件，可以将大量测序结果格式化，使其能够被一种RNA预测软件读取，进而预测出RNA二级结构。(科学网 任春晓/编译)
相关方法：“片段化测序”法
完成人：索菲·萨拉马课题组
实验室：美国加州大学圣克鲁兹分校霍华德·休斯医学研究院 加州大学圣克鲁兹分校巴斯金工程学院生物分子科学与工程学中心 美国罗切斯特大学物理与天文学系 美国罗切斯特大学生物化学与生物物理系。
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