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1.2.4 流式细胞术检测各组细胞周期及凋亡情况 将各组细胞收获后，用PBS洗涤1次，-20℃ 75%乙醇固定过夜，取出离心收集细胞，PBS洗涤2次，加入10g/L Rnase37℃孵育15min,再加入碘化丙锭（PI）染色30min，300目尼龙网过滤，采用FAC SAricaTM流式细胞仪检测细胞周期及凋亡状况。各组细胞再加入诱导凋亡最佳浓度的ADM培养48h后用上述相同方法处理，上机检测细胞凋亡及细胞周期的变化。
1.3 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，流式细胞仪检测的凋亡率及细胞周期的比较采用χ2检验。MTT检测细胞增殖的比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Bel7404/HBx的筛选
采用G418浓度为500mg/L的选择培养基培养14d后,对照组细胞全部被杀死, 转染HBx基因的Bel7404细胞可见有阳性克隆的形成。
2.2 HBx基因表达检测结果
林松挺等.乙型肝炎病毒X基因对肝癌细胞Bel7404细胞周期的影响
RTPCR显示，实验组Bel7404/HBx及重组质粒pcDNA3.1/HBx可见HBx条带，而空白对照组Bel7404细胞与空载体对照组Bel7404/pcDNA3.1均未见HBx条带（图1），表明Bel7404/HBx在转录水平上有HBx mRNA的表达；Western blot显示实验组可见HBx蛋白表达条带，而空白对照组与空载体对照组则未见HBx蛋白表达条带（图2）。表明稳定表达HBx的转基因细胞株Bel7404/HBx构建成功。
图1 RTPCR鉴定阳性克隆中HBx mRNA的表达
图2 Western blot鉴定阳性克隆中HBx蛋白的表达
2.3 细胞增殖情况
MTT法检测各组细胞A值发现，Bel7404与Bel7404/pcDNA3.1细胞生长速度基本一致（P>0.05）， 而Bel7404/HBx细胞在48、72、96h各时间点的A值均明显高于对照组Bel7404细胞和Bel7404/pcDNA3.1（P<0.05）, 表明Bel7404/HBx细胞生长速度明显加快（图3），显示HBx对Bel7404细胞具有促增殖作用。
图3 Bel7404 /HBx、Bel7404/pcDNA3.1和Bel7404细胞生长曲线
2.4 流式细胞仪检测凋亡及细胞周期
各组细胞培养48h经PI单染后用FACSAricaTM flow cytometer检测，重复实验3次，每次每组检测5×104个细胞，结果显示，与对照组相比，Bel7404/HBx凋亡率降低（P<0.05)，G1期细胞比例减少（P<0.05)，S期与G2期细胞比例相应增加（P<0.05）,见表1。
表1 3组细胞的凋亡率及各细胞周期所占比例的比较 %(±s）
组别凋亡率
细胞周期
G1SG2
空白对照组(Bel7404)12.64±0.0262.38±0.0336.03±0.011.36±0.02
空载体对照组(Bel7404/pcDNA3.1)9.58±0.0163.46±0.0136.01±0.000.53±0.00
实验组(Bel7404/HBx)2.97±0.01*52.64±0.01* 41.08±0.01* 5.51±0.00*
注：与对照组相比，*P<0.05。
3 讨论
HCC是世界范围内恶性程度最高的肿瘤之一，每年有超过50万人死亡，我国为肝癌高发区，病死率在各种肿瘤中占前列，占癌症死亡率第2位。虽然目前肝癌的研究已有长足的进步，但其预后仍然很差，因此，肝细胞癌是严重危害人民身心健康的恶性肿瘤之一，故深入研究HCC的分子机制对肝癌提供新的防治策略具有十分重要的意义。研究证实，HBV基因组共有4个开放阅读框：prec/c、p、pres/s与X基因［1，2］，其中X基因是最小的一个开放阅读框，编码基因区位于 1374～1838核苷酸之间，编码产物为HBx蛋白,具有强大的生物学功能，包括反式激活病毒基因组和宿主细胞基因的转录、增强转录因子DNA结合特性、抑制P53蛋白活性、抑制细胞DNA的修复、参与细胞信号传导途径和细胞凋亡的调控等［3］，这些功能可能与原发性肝细胞癌的发生具有密切的关系［4-7］。研究证实，HBx在体内和体外均可诱导肝细胞的恶性转化及癌变［8，9］，这些为HBx引发原发性肝细胞癌提供了依据。但也有研究表明，单纯的HBx基因表达并不足于引起肝细胞癌，可能是细胞恶性转变的一个促进因素,也就是增加机体对致癌物质诱导肝癌的易感性［4，8］。由此可见，HBx致癌机制复杂，且目前的研究尚不能确定HBx在HCC中的确切作用［4，8］，许多研究结果仍存在很大争议，有的结果甚至相互矛盾，故HBx致癌机理一直是近年研究的热点。
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