临床检验医学网-幸福检验

    原发性肝细胞癌(HCC)一直以来是危害人民身心健康的一大疾病，其发病机理多种多样，其中HBV在其发病中一直占据重要的地位。目前研究证实，HBV中最小的阅读框X基因在HCC发生中所起的作用至关重要，但各家研究结论不太一致，有的结论甚至互为矛盾，这也使得HBx致癌机理尚未研究清楚。因而，HBx致HCC机理仍然是目前研究的热点，为此，我们以重组质粒pcDNA3.1 (＋) /v5hisBHBx作为载体，通过脂质体转染将X基因导入肝癌细胞Bel7404细胞系中，用G418筛选获取稳定表达HBx蛋白的阳性克隆，并观察HBx对肝癌细胞Bel7404增殖、凋亡及细胞周期的影响，为进一步探索HBx与HCC之间的关系提供更为完善的理论依据，希望能为肝细胞癌的预防、诊断及治疗提供新的策略。

1  材料与方法

1.1  材料

   
Effectene Transfection Reagent（Qiagen）；G418（Promega）；各种限制性核酸内切酶、聚合酶等（Takara）；鼠单克隆抗体（ABCam）；羊抗鼠IgG(晶美)；DMEM 、MTT及PI(sigma)。重组质粒 pcDNA3.1（＋）/v5hisBHBx由上海第二军医大学遗传研究所何晓文教授惠赠；DH5α由西班牙Navarra大学癌症基因研究所钱程教授提供；Bel7404细胞由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所刘新垣院士惠赠。扩增HBx基因片段上游引物为：5′ CGGAATTCCGATGGCTGCTAGGCTGTG3′,命名为P1,下游引物为：5′CCCTCGAGGGTGCATGGTGCTGGTGA3′,命名为P2，扩增目的片段为445bp,PCR引物合成及测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2  方法

1.2.1  Bel7404细胞的转染与筛选  重组质粒 pcDNA3.1（＋）/v5hisBHBx经酶切、PCR及测序鉴定后按Effectene Transfection Reagent说明书进行转染操作，48h后用含500mg/L G418的选择培养基筛选阳性克隆。筛选至对照组细胞全部死亡后实验组存活的细胞即为阳性克隆，挑取克隆扩大培养并将G418浓度减至250mg/L维持筛选，以获得稳定表达HBx的转基因细胞株（Bel7404/HBx）。实验设空白对照组（Bel7404细胞）与空载体对照组（转染pcDNA3.1的Bel7404细胞，Bel7404/ pcDNA3.1）。以下所设对照组与此相同。

1.2.2  转基因细胞株Bel7404/HBx的鉴定  采用聚合酶链反应（RTPCR）检测HBx mRNA的表达: TRIzol一步法提取各组细胞总RNA（按试剂盒说明书操作），经逆转录生成cDNA，取2μL cDNA作模板，以上述引物扩增HBx基因片段，条件如下：94℃预变性10min，94℃变性45s，52℃退火1min，72℃延伸1min，扩增30个循环，2%琼脂糖凝胶电泳后成像观察。Western blot检测HBx 蛋白的表达:各组细胞培养48h后置冰上PBS洗涤2次，加入冰预冷的细胞裂解液100μL(按1∶100加入PMSF)充分裂解细胞，4℃ 13000g离心2min,上清即总蛋白，转上清至另一EP管中,加入适量2×SDS凝胶加样缓冲液(65mmol/L TrisHCl,pH：6.8;100mmol/L DTT;2%SDS;0.1%溴酚蓝;10%甘油),100℃加热5min使蛋白变性,4℃ 3600g离心2min,采用BCA试剂盒检测蛋白浓度(按说明书操作),取适量蛋白样品行SDSPAGE电泳，然后半干转印于NC膜上，封闭液室温封闭1h，加入鼠单克隆HBx抗体(一抗)，4℃孵育过夜，以TBST振摇洗涤3次，每次5min，加入羊抗鼠IgG(二抗)，室温孵育1h，接着以TBST振摇洗涤4次，每次5min，直接用Odyssey双色红外激光成像系统检测结果。

1.2.3  四唑兰比色实验（MTT）检测细胞的增殖及凋亡  各组细胞消化后配成单细胞悬液，以1×104细胞/孔接种于96孔板，共4板，各设4复孔,另设一PBS对照孔。培养24h后，取出1板每孔加MTT溶液（0.5g/L）100μL，置培养箱继续培养4h，吸弃孔内上清液，每孔加入150μL的DMSO，振摇15min溶解结晶，酶联免疫检测仪于595nm波长处分别测定各孔光吸收值（A值），取其均数作为本次A值计数值。培养48、72、96h后再重复上述步骤检测，以时间为横轴，A值为纵轴绘制各组细胞生长曲线图。