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血氨主要来自肠道内肠菌酶类对未消化吸收的蛋白质氨基酸的腐败作用，以及对尿素分解产生的氨。血氨的测定方法有许多种，如扩散法、去蛋白波氏比色法、离子交换层析法、氨电极法、酶法、干化学法等［1］。但扩散法及波氏比色法灵敏度低，准确性及精密度不佳；离子交换层析法需长时间处理；氨电极法准确度和精密度较好，但稳定性受多种因素影响，尚难普及使用；干试剂酶法可用在半自动生化仪上，但手工操作过程干扰因素多，且干粉试剂溶解后有效期短，难以控制测试的准确度和精密度，加上血氨测定样本少，使测试成本增高。因此，寻找一种更准确、灵敏、简便、经济的测定血氨的方法具有实际意义，笔者拟在全自动生化仪上建立液体双试剂连续监测法测定血氨，结果准确，现报告如下。 1 材料和方法 1.1 仪器 美国贝克曼库尔特公司CX5-CE型全自动生化分析仪。 1.2 试剂 ①试剂Ⅰ：装载量100ml，其中含三乙醇胺缓冲液0.25mol/L，α-酮戊二酸15mol/L，NADH 0.3mmol/L，ADP 1.5mmol/L，pH为7.4，2～8℃下稳定半年。②试剂Ⅱ：装载量15ml，含谷氨酸脱氢酶（GLDH） ≥160u/L，2～8℃下稳定1个月。 1.3 原理 NH+4+α-酮戊二酸+NADHGLDH L-谷氨酸+NAD++H2O 1.4 方法 ①液体双试剂连续监测法，试剂Ⅰ200μl，样本30μl，试剂Ⅱ50μl，先加入试剂Ⅰ，320s后加入样本，第440s加入试剂Ⅱ。②读空白时间：开始280s，结束300s。③反应时间：开始500s，结束560s。④反应温度：37℃。⑤波长：主波长340nm，副波长410nm。⑥计算公式： NH+4μmol/L=△A/min280×106 6220×30×0.5 2 实验结果 2.1 最适pH 实验溶液的最终pH范围为7.0～7.8（用日本拜尔公司850血气分析仪检测），其它条件（温度、时间、酶含量和底物浓度）相同，对一份血浆样本进行血氨检测，结果见表1。表明实验溶液pH越接近7.4，测定值反映越真实。 表1 最适pH、GLDH浓度观察（略） 2.2 GLDH用量选择 试剂Ⅱ中GLDH的活性浓度分别为80，120，160，200，240u/L，其他条件不变，测定一份血浆样本的血氨浓度来观察GLDH浓度，结果显示试剂Ⅱ中GLDH的活性为160u/L时反应曲线已趋平坦，故确定试剂Ⅱ中GLDH的活性浓度为160u/L。见表1。 2.3 反应进程 试剂Ⅰ200μl，样本30μl，混合，37℃孵育2min，加入试剂Ⅱ40μl，340nm连续监测5min，仪器每间隔16s读1次吸光度值，根据结果显示在1～3min之间呈线性，因此，设定延迟时间为1min，测定时间1min。 2.4 试剂的稳定性 装机试剂每日对一份血氨标准液（浓度为55.5μmol/L，北京中生公司产品）进行测定一次，当测定结果偏离标准值5%时，对试剂Ⅰ、Ⅱ分别更换重测，若结果能得到纠正即为该试剂的有效期，结果本法试剂Ⅰ、Ⅱ有效期分别为：试剂Ⅰ半年，试剂Ⅱ1个月。 2.5 线性实验 使用混合病人血浆制备5个水平浓度样本，制备混合血浆准备如下［2］：低浓度χ1混合血浆，高浓度χ5混合血浆；血浆χ2=3份“χ1”+1份“χ5”；血浆χ3：2份“χ1”+2份“χ5”；血浆χ4=1份“χ1”+3份“χ5”。配制的标本浓度按公式 |