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采集标本 标本的选择根据感染部位。可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相应部位分泌液或组织细胞。 直接涂片镜检 标本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般用Ziehl-Neelsen法。为加强染色，可用IK(intensified Kinyoun)法染色。将石炭酸复红染色过夜，用0.5% 盐酸乙醇脱色30s，则包括大多结核分枝杆菌L型也可着色。为提高镜检敏感性，也可用金胺染色，在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈显金黄色荧光。
浓缩集菌 先集菌后检查，可提高检出率。培养与动物试验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH（痰和碱的比例为1:4,尿、支气管灌洗液和碱的比例为1:1）处理15min，时间过长易使结核分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量筒内静置，取沉淀物处理。处理后的材料再离心沉淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一步作培养或动物接种，应先用酸中和后再离心沉淀。
分离培养 将经中和集菌材料接种于固体培养基，器皿口加橡皮塞于37℃培养，每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2～4周长成肉眼可见的落菌。液体培养可将集菌材料滴加于含血清的培养液，则可于1～2周在管底见有颗粒生长。取沉淀物作涂片，能快速获得结果，并可进一步作生化、药敏等测定和区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。国内学者已证明结核分枝杆菌L型可存在于血细胞内或粘附于细胞表面。这种患者往往血沉加快，用低渗盐水溶血后立即接种高渗结核分枝杆菌L型培养基能提高培养阳性率。
动物试验 将集菌后的材料注射于豚鼠腹股沟皮下，3～4周后若局部淋巴结肿大，结核菌素试验阳转，即可进行解剖。观察肺、肝、淋巴结等器官有无结核病变，并作形态、培养等检查。若6～8周仍不见发病，也应进行解剖检查。
快速诊断 一般涂片检查菌数需5x103～4/ml,培养需1x102/ml,标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果，且培养需时较长。目前已将多聚酶链反应（PCR）扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，每ml中只需含几个细菌即可获得阳性，且1?2d得出结果。操作中需注意实验器材的污染问题，以免出现假阳性。又细菌L型由于缺壁并有代偿性细胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使细胞膜破裂释出DNA，以致造成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，则可出现阳性。目前有条件的单位使用BACTEC法，以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基，测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌，5～7d就可出报告。
近年来国内外研究证明临床各种类型的肺结核患者中40% 左右分离出L型。经治疗的结核病人细菌型消失，L型常持续存在。有空洞患者痰中已不排细菌型者，8% 左右仍可检出L型。故有学者建议将多次检出L型亦作为结核病活动判断标准之一，细菌型与L型 均转阴才能作为痰阴性。
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