|
霍乱是一种烈性肠道传染病,其早期诊断有利于及时治疗和传染源隔离。本文报道一种快速检测O1群霍乱弧菌的胶乳凝集试验(LAT),标本增菌6小时即可进行检测,LAT操作时间不足5 min。 1 材料和方法 1.1 试剂 抗O1群霍乱弧菌多价单克隆抗体由上海市卫生防疫站提供；羧化聚苯乙烯胶乳(0.8 μm)由上海市临检中心提供；SPA-Sepharose 4B购自Sigma公司。 1.2 标本 疑似霍乱粪便标本92例,取自1994年7～9月间就诊的腹泻病人,接种碱性蛋白胨水37℃增菌6 h后转种TCBS平板进一步鉴定。所剩碱性胨水培养物隔水煮沸灭菌,－30℃冻存。临用前室温融化,旋涡混匀。阳性对照由上海市普陀区卫生防疫站提供,其菌液浓度为1.3×108 CFU/ml。阴性对照为大肠埃希菌菌落混悬于碱性蛋白胨水中。107例其它肠道杆菌标本由本科和上海市长宁区中心医院检验科提供。 1.3 单克隆抗体纯化 按文献［1］方法进行。1.5 g SPA-Sepharose 4B用10.0 ml pH 8.0 0.01 mol/L PBS溶胀、装柱。2.0 ml单克隆抗体用PBS1∶4稀释后上样，关紧出水口，4℃ 2 h。PBS冲洗后用pH 4.0 0.1 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液解析。收集解析液中含抗体活性管用pH 9.0 1.0 mol/L Tris-HCl中和，置透析袋中PEG-20000浓缩，pH 7.2 0.02 mol/L PB充分透析，测蛋白浓度。柱用pH 3.0 0.1 mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液再生。 1.4 免疫胶乳制备 按文献［2］方法进行。2.5 ml 100 g/L羧化胶乳中加2.5 ml 0.02 mol/L正氨基已酸和5.0 ml pH 7.2 0.2 mol/L PB。加50 mg碳化二亚胺，室温搅拌1 h，用PB离心洗涤后配成25 g/L浓度。取1.0 ml此胶乳中加入一定量的纯化抗体及7.5 mg碳化二亚胺，37℃搅拌2 h。加100 μl pH 8.4 0.1 mol/L甘氨酸缓冲液，30 min后用PB离心洗涤两次，用含1 g/L NaN3的PB配成10 g/L胶乳悬液，4℃存放。 1.5 胶乳凝集试验 在黑色玻璃反应板小方格内，各加1滴(约50 μl)增菌6 h的碱性蛋白胨水和免疫胶乳试剂，轻轻摇动，5 min内观察结果。出现清晰、均匀一致的凝集颗粒者为阳性，反之为阴性。每次试验均设阴、阳性对照。 2 结果 2.1 LAT的敏感性 阳性对照用碱性蛋白胨水倍比稀释到5×105 CFU/ml时仍出现清晰的凝集颗粒。 2.2 LAT的特异性 107例其它肠道杆菌标本，其中副溶血性弧菌15例，非O1群霍乱弧菌20例，温和气单胞菌15例，亲水气单胞菌10例，类志贺邻单胞菌8例，伤寒沙门菌14例，志贺菌20例(福氏16例，宋内4例)，普通变形杆菌5例。各取一定量的菌落(或菌苔)于碱性蛋白胨水中制成悬液，进行LAT检测。结果均为阴性。 2.3 重复性和稳定性 将致敏胶乳保存于4℃冰箱，对5×105 CFU/ml菌液浓度的阳性对照和特异性试验中的副溶血性弧菌、非O1群霍乱弧菌、温和气单胞菌、伤寒沙门菌各10例每两周测定1次，三个月内共测定6次，结果相同。致敏胶乳一年内对阳性对照测定的敏感性不变。 2.4 与培养法结果的比较 92例临床标本，培养法阳性44例，均为El-tor生物型小川血清型霍乱弧菌，LAT检测均阳性；培养法阴性48例，LAT检测47例阴性，1例阳性。此例LAT检测时呈大小不一的凝块，经进一步鉴定为酵母菌。 3 讨论 在免疫胶乳制备中，所用单抗与O1群霍乱弧菌菌体抗原A、B、C均可发生反应，因此El-tor弧菌中的三个血清型均可被检出。但在临床标本测定中，所检出的44例均为小川血清型霍乱弧菌，未见稻叶型和彦岛型，原因为当年夏秋季的菌株为小川型。在实际应用中，对以下两种情况要予以重视：一是碱性胨水表面长有菌膜时要将其充分混匀，吸取菌膜下层液体检测；否则粘稠的菌膜会影响结果的判断。二是对阳性标本同时用显微镜检查，若发现有真菌芽生孢子时即可报酵母菌，而不能报告El-tor弧菌。 |