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原发性肝癌（primary hepatic cancer，PHC）在我国农村和城市分别处于恶性肿瘤病死率的第一、第二位，全世界每年有38.6万人死于肝癌，其中４５%在中国［1］。甲胎蛋白（AFP）多年来被作为诊断PHC的首选指标，但有２０％～４０％的PHC患者ＡＦＰ阴性或低值［2］。为提高PHC血清标志物检测的灵敏度，本实验利用蛋白芯片技术联合检测PHC病人血清AFP、糖原125（CA125）、糖原199（CA199）、癌胚抗原（CEA）等四项指标，探讨其对PHC的诊断意义。 1 对象和方法 1.1 对象 肝癌组 162例PHC患者来自本院附属医院住院及门诊病人，其中男102例，女60例，平均46.3岁，均通过病理检查确诊；良性肝病组129例，其中肝硬化42例，肝炎87例，男78例，女51例，平均41.3岁；正常对照组140例，均为门诊健康查体者，其中男90例，女50例，平均40.7岁。 1.2 方法 1.2.1 样品的采集 所有研究对象均于早晨空腹静脉采血3ml，分离血清，立刻检测。 1.2.2 仪器和试剂 试剂盒为湖南数康生物科技有限公司生产的C-12型肿瘤诊断用蛋白芯片试剂盒（简称C-12），并采用其提供的HD-2001A生物芯片检测仪分析结果。 1.2.3 实验方法 将各待测血清及不同浓度的标准品混合液各100μl滴加到不同的芯片分格内；将蛋白芯片在37℃温育振荡30min，倾倒弃去孔内液体；吸取200μl洗涤液加入芯片格内，振荡洗涤5min，弃去洗涤液；重复洗涤2次；每芯片分格内各加入100μl反应液，再次将蛋白芯片在37℃温育振荡30min，然后倾倒弃去孔内液体，按上述方法重复洗涤2次，剥离蛋白芯片集成块的上部，在每个芯片的膜表面加入20μl已等体积混合15min的检测液A和B混合液，静置2min，重复洗涤2次，用HD-2001A生物芯片检测仪对蛋白芯片读取数据。 1.2.4 检测项目的正常参考值范围 CA125＜35ku/L，CA199＜35ku/L，AFP＜20μg/L，CEA＜5μg/L。测定结果超过正常参考值范围上限即为阳性。 1.3 统计学处理 计数资料采用χ2检验进行分析。 2 结果 2.1 正常组、良性肝病组、肝癌组四项指标检测结果 见表1。肝癌组的阳性率显著高于良性肝病组和正常对照组（P均<0.01）。采用蛋白芯片联合检测AFP、CA125、CA199、CEA等四项指标，可将肝癌的诊断阳性率提高到83.95%，特异性为77.70%，阳性预测值为69.39%，阴性预测值为88.94%，有效性为80.05%。 2.2 联合检测与单项检测标志物检测敏感性与特异性比较 见表2。与单项标志物比较，联合检测提高了诊断敏感性（χ2=39.38，P<0.01），但特异性有所下降（χ2=13.31，P<0.01）。 表1 正常组、良性肝病组、肝癌组四项指标检测结果（略） 与肝癌组比较，a:χ2=59.81，b：χ2=184.27，P均<0.01 表2 联合检测与单项检测标记物检测敏感性与特异性（略） 3 讨论 目前认为AFP为肝癌可靠的血清标志物，应用AFP早期诊断PHC，当AFP≥400μg/L时可确诊为PHC，且灵敏度一般为60%～70%，特异性为90%左右，但约18%的PHC患者的AFP值不升高，其原因可能是AFP含量与肿瘤体积大小有关。王果等［3］报道，肿瘤体积<3cm3的PHC患者的AFP含量明显低于肿瘤体积＞3cm3的PHC患者，易造成假阴性结果。还有文献报道［4］，对早期PHC、AFP的假阴性率可达40%以上，进展期PHC、AFP的假阴性率为15%～20%。因此，单凭AFP诊断PHC易造成漏诊与误诊，为提高PHC尤其是小肝癌的诊断敏感性，临床上常将多种标志物进行联合检测。生物芯片是近年来在生物科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它是将生物分子固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵。在待分析样品中的生物分子与生物芯片上的探针分子发生杂交或相互作用后，利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析。在此基础上发展的微流体芯片，则是将整个生化分析过程集中于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质及其它生物成分进行高通量检测，它将生命科学研究中所涉及的许多分析步骤，利用微电子、微机械、化学、物理技术、传感技术、计算机技术等，使样品检测和分析过程连续化、集成化、微型化。生物芯片可以大规模高通量地对成千上万个基因进行同时研究，从而克服了传统分子生物学技术操作繁琐、自动化程度低、检测效率低等不足，为基因和蛋白质功能的研究提供了强有力的工具。Eggeling等［5］利用该技术对8例肾癌患者进行了检测，结果显示，该技术可以在蛋白质水平上反映肿瘤的变化。 CEA对由胚层分化来的肿瘤，特别是消化道腺癌的阳性检出率较高，而且肝转移性癌比原发性肝癌更易引起CEA升高。文献报道［6］，CEA对肿瘤的早期诊断不理想，但在鉴别原发性肝癌和胃肠转移性肝癌具有显著性特点。CA199对胰腺癌有重要的诊断价值，而CA125是诊断卵巢及生殖系统肿瘤的重要肿瘤标志物，近年来有研究显示两者对肝癌的诊断有一定价值［7］。本组结果表明，应用蛋白芯片四项指标联合检测可以提高PHC诊断的敏感性（83.95%）和阴性预测值（88.94%），减少漏诊率，其临床意义大于单项指标。但联合检测在提高诊断的敏感性的同时，特异性却有所下降，诊断时需排除假阳性。因此，在应用蛋白芯片检测出可疑假阳性结果时，应结合临床病史及有关实验室、影像学及病理组织学检查，最后作出正确诊断。 |