14.计算因子F值(或系数K)
14.1 理论F值
用连续监测法进行酶活性测定时,不需作标准管或标准曲线,根据摩尔消光系数很容易进行酶活性浓度的计算。先测定在线性范围内每分钟吸光度的变化(ΔA/min),以U/L代表酶活性浓度时,则可按下式进行计算:
U/L=ΔA/min=ΔA/min×V×106/(ε×v×1)
式中V:反应体系体积(ml);ε:摩尔吸光系数(cm2/mol);v:样品量(ml);l:比色杯光径(cm);ΔA:吸光度变化;106:将mol换算成μmol。
因此当条件固定时,从理论上讲V、v和l均为固定值,ε为常数,则上述公式可以简化为U/L=ΔA/min×F,F=V×106/(ε×v×1)。
系数F值对酶的测定十分重要,过高虽然测定的线性较宽,但重复性差,反之,虽然精密度好,但检测线性窄,因此应根据实际情况进行合理的设置和应用,F值的设置应参考酶参考值的上限及测定时间两方面,以保证测定结果的可靠。
14.2 实际F值
在临床实际工作中,仪器诸多因素如波长的准确性、半波宽的大小、比色杯光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等若不符合要求或发生变化都会影响指示物的ε值或上述公式中的相关项。因此,应在具体仪器条件下,定期检查和实际测定指示物的ε和系数F值(即仪器的实测F值)。
NAD(P)H的ε值因NAD(P)H不稳定,可用葡萄糖的己糖激酶法实测,其原理为:
GLU + ATP----HK ---- G-6-P + ADP ;
G-6-P + NAD(P)+ ---- G-6-PD ---- 6-磷酸葡萄糖酸 + NAD(P)H + H+
将某一浓度的葡萄糖溶液(可设为10 mmol/L)重复5-10次测定,得到相应的吸光度,求出A bar±s,s必须低于仪器规定的批内允许值。根据ε =A bar/(C×l)× V/v求出NAD(P)H的实际ε值,式中C为标准液浓度(mol/L);l为比色杯光径(cm);V为反应总体积(ml);v为样品体积(ml)。再根据U/L=ΔA/min × F,得到实际F值= C×106/A bar。
此外,一些色素源指示物在不同的介质环境中,其ε会发生程度不等的变化。对于对硝基苯酚、对硝基苯胺和5-硫代-2-硝基苯甲酸等测这类可得到高纯而稳定的指示物,可将其配置在一定的介质中,按临床标本用的现场试剂和仪器测定吸光度求实测ε及实侧F值。
15. 前区检查
免疫比浊分析过程中必须设置。比较免疫比浊分析过程中后两个读数点的差别,如果后一点比前一点的吸光度低,则表示抗原已过剩,应将样品稀释后重测。
16. 线性回归方程
以标准液代样品在仪器上测得的结果为横坐标,标准液的实际浓度为纵坐标绘制而成的曲线,其中A为曲线在纵轴上的截距,B为曲线的斜率,用于修正检测结果。
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